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超實用流式細胞術常見問題解答!

2021-09-10 11:46 作者:洛辰 來源:上海遠慕生物試劑
1、用于做Western 或ELISA的一抗可否用于流式細胞術?
看你說明書上是怎么說的了,如果沒有說就不可以做流式,需要另外買了。

2、請問流式細胞術單抗直接熒光需要幾種對照?
首先確認你用的直標抗體的熒光染料是什么,再確定該抗體的來源種屬,選擇相應的同型對照。如:你現在想檢測小鼠淋巴細胞表面的CD4抗原, 熒光染料為FITC, 抗體來源為大鼠的IgG1亞型, 即Rat anti Mouse CD4-FITC (IgG1), 你所需要的同型對照就應該是Rat IgG1-FITC, 一般的抗體說明上都會寫清。

3、6孔板的細胞量能否做流式呀?
對于6孔板而言,每孔的表面積為10 cm2,依細胞種類不同在長滿時達到的數量從5*10的5次方到5*10的6次方不等。6孔板絕對沒問題的!甚至24孔板也可以正常做。不過用于調試儀器參數的正常細胞要多準備一些。

4、流式中檢測細胞表面和細胞內蛋白表達水平的抗體有何區別?
抗體只是針對相應抗原的,至于是針對胞內還是胞膜對你檢測來說并無明顯影響,你只需要查清楚到底是針對哪一個部位的抗原的,應該是可以用同一種抗體進行檢測的,在流式操作時只需注意:如果是針對胞內,則需要加破膜劑,讓抗體能和相應抗原接觸,否則就不需要了。

5、只要是熒光抗體就可以用于共聚焦顯微鏡嗎?
一般情況下都是可以的。但有時候強度不夠,需要選擇熒光強度大的染料。

6、流式細胞儀檢測細胞周期是否需要雞紅細胞作參照?
不用,標準微球做完laser alignment(光路校正)就可以了。盡量把微球的各色CV值控制在1.5以內。

7、流式細胞儀上的FL2-W FL2-A FL2-H 分別是做什么的?
FL2-W是只檢測熒光的脈沖寬度, FL2-H是指脈沖高度。通常在做細胞周期分析時應用,用于去除粘連細胞。

8、細胞膜蛋白變化是用流氏檢測好,還是要做western?
膜蛋白的提取,好像很費功夫,提取的不好,western結果也就不可信。流式需要的抗體很少,流式能夠檢測陽性表達細胞的比例,western能對總的表達定量,各有有缺點。

9、培養細胞的bcl-2及Bax蛋白的檢測?
首先制成單細胞懸液,PBS洗滌后用胞內染色試劑盒(很多公司都有,其實就是固定劑加增透/打孔劑)進行處理,再進行抗體孵育標記染色,洗滌后上樣。

10、如何分選原始紅細胞?
CD71(轉鐵蛋白受體)--幼稚細胞的標記
CD235(GPA)--紅細胞的標記(小鼠有Ter119)
雙陽性細胞即為幼稚紅細胞,但無法區分原始及中晚幼紅.

11、怎樣選擇流式同型對照?
同型對照(Isotype Control):使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白,用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產生的背景染色。如果一抗是多抗,可以用an normal serum(與一抗相同的正常血清) (must be the same species as primary antibody)。This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.這個可以咨詢試劑商。同型對照為免疫熒光標記中的陰性對照。由于熒光標記單抗的組來源不同,應選用相同來源的未標記單抗作為同型對照來調整背景染色。舉個例子:比如檢測一抗為單抗的mouse anti rat CD11b,clone OX-42 purified IgG,那么它的isotype 是mouse IgG2a, 所以可以用purified(純化的) mouse IgG2a來做OX-42的同型對照(Isotype Control)。一般的的生物技術公司和國內的代理都有出售。

同型對照:是指與MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亞類,若使用直接免疫熒光染色法,同型對照也應標記熒光色素,如IgG1 FITC、IgG2a、PE等。主要考慮了細胞的自發熒光、FC受體介導的抗體結合和非特異性抗體結合等影響因素。此外,同型對照與MoAb所標記的熒光色素、濃度、F:P比值(標記的熒光色素與免疫球蛋白分子的比值)應該相同為最佳,這對準確設定陰性與陽性細胞的界標有重要意義,切忌使用與MoAb不相匹配的同型對照,最好為同一實驗室、采用相同工藝或方法制備(如同一品牌)的產品。

12、流式細胞技術測定細胞內游離鈣濃度為何要使用氯化鈣。
在文獻及其他專業網站中都有測定游離鈣的方法,具體如下:
(1) 鈣熒光探針負載;
(2)隨機測定每管細胞懸液樣品(以下簡稱樣品)的單個細胞的熒光強度,記為F值。
(3)加入10%Triton X 100,(破膜用);加入1 mmol/L氯化鈣,(問題所在),吹打均勻,孵育1~10min,測定熒光即Fmax值。
(4)加入EGTA,20%26mu;l(鈣螯合劑),孵育1~10min,激發波長488nm測定熒光,即Fmin值。這個過程中的氯化鈣的作用如何, 請高人指點, 謝謝。
因為正常血漿中Ca2+濃度是1mM,細胞外液的Ca2+對細胞內Ca2+有影響。加0.1%triton是增加膜通透性,使細胞外Ca2+進入細胞內,作為最大值。加EGTA是為了螯合Ca2+,作為最小值.生理環境中細胞內鈣離子濃度遠低于細胞外液(大約1:10000),細胞膜對鈣的通透性變化對細胞內鈣影響很大。

13、流式與werstern的區別有哪些?
(1)Western 是檢測蛋白表達的金標準,可用于檢測細胞多種類型的蛋白;流式細胞術的方法多用于檢測細胞膜蛋白,雖然也可通過Triton-X100給細胞打孔的方法來檢測胞內蛋白,但對于分泌蛋白卻是無能為力的;
(2)Western測蛋白含量對抗體的量需要很少,一般1:1000左右,而流式對抗體的需要量很大,一般1:50(很浪費抗體);
(3)采用Western方法檢測細胞蛋白含量的變化一般要有內參,而流式一般要把每個樣品分為兩份,同時都做只加二抗(FITC標記的)的對照,這樣平均到每個細胞的發光就不用內參了;
(4)就個人經驗而言,流式用多抗不好,單抗標出來不錯。
不過流式的應用原理主要還是抗原和抗體反應和western、免疫組化沒有本質差別,但是由于免疫組化和western都有酶催化底物的放大體系,因此,流式不適合檢測低表達的蛋白,低表達的還是采用western(尤其是化學發光底物更佳)和免疫組化更好。當然,流式最大的一個特點就是,可以定量(百分比),如果是高表達的用流式細胞儀非常有優勢。

14、FL1, FL2, FL3 的區別是什么? 是指在不同位置測得的熒光?還是不同波長的熒光?這3個參數到底測的是什么?有什么意義?
你的理解是正確的,其實FL1, FL2, FL3 是指不同的熒光通道.舉個例子來說吧.我們用FITC/PE雙標記的細胞,在488nm的激光激發下,這兩種熒光染料分別發出波長不同的綠色和橙色熒光,然后這發出的熒光再通過濾光片分開,對應的是不同的波長的濾光片,一般在fl1那的是530nm的濾光片,在FL2那的是575nm的濾光片,這樣就可以把在一起的熒光分開了。

15、MFI和GFI的意義?
Geo Mean,叫做幾何均數(geometric mean),常用于等級資料和對數正態分布資料,和常用的算數均數(mean)的計算方法不同。%26ldquo; %total或者%gate的結果%26rdquo;代表的是百分率,即細胞占總體細胞或者是門內細胞的百分比;用百分比作為統計指標,適用于熒光表達較強的指標。我看到你的流式圖上,檢測樣本的熒光強度不是很強,屬于弱表達的指標,若用百分率統計,就是會失去一部分弱陽性的數據。我建議可以用平均熒光強度(也就是mean值)作為統計指標,比較熒光強度的變化。

16、流式技術中的APC,pure 標記是什么意思呢?
熒光物質通常是指那些在受到一個波長激發后,處于一個能量不穩定的狀態,能發射一個波長比激發波長長的光的一類物質。當然熒光并不都是受激發后發射的,如一些生物可以發射熒光,如熒火蟲,發光細菌等,他們發出的光是通過體內的酶促反應而產生的,這個酶通常被稱為熒光素酶.EB是一種熒光物質,它在受到紫外線照射后可以發出一可見光,常用于DNA、RNA電泳中。
APC英文全名:allophycocyanin;中文名:別藻青蛋白;最大吸收峰:650nm,最大發射熒光峰:660nm,適用于雙激光流式儀,可被600-640nm波長的激光激發。
PerCP英文全名:peridinin chlorophyll protein,中文名:多甲藻葉綠素蛋白;最大激發波峰490nm,被488nm的氬離子激光激發后,發射光峰值約為677nm,與FITC、PE進行多色熒光染色補償重疊較少,非特異性結合也較少。雖然較易使用,但量子產量不高,多用于檢測表達較高的抗原。

17、怎樣用流式細胞儀來鑒定小鼠BMDC?
檢測小鼠BMDC主要是從形態學和細胞表面分子兩方面來鑒定我做的時候就做了普通光鏡下形態、電鏡(掃描和透射),另外檢測了小鼠BMDC表面的共刺激分子如CD86 、CD11、CD80。還做了MHC II類分子的檢測,還有MHCI類分子的檢測,這些分子在DC表面都不是特異存在的,在巨噬細胞、淋巴細胞表面也有表達,所以目前并沒有非常特異性的方法檢測你的細胞一定就是DC,但是從形態和表面分子的檢測結合來看,效果就比較好了.一般在幼稚的DC上述分子表達水平較低,DC成熟過程中,上述分子表達呈上調趨勢,你可以在不同的培養時間分別檢測。

18、血液里的mononuclear cell(除外紅細胞,血小板和破碎的細胞碎片),能不能用細胞大小來gating,只看我關心的細胞?
(1)紅細胞還是小一些,無法100%區分,但還是可用把大部分紅細胞gate掉。
(2)溶血也很重要,如果你的紅細胞多的話。(我猜不少,如果用ficol的話)??梢杂寐然@溶液,如ACK(Lonzo),
(3)CD45是所有白細胞都表達的,可以用來區分RBC vs. WBC

19、FCM檢測表達結果到底是用百分比還是MFI。我作出是單峰,原本我覺得用MFI表示較好。但我做的2個蛋白很奇怪,一個表達率高,但MFI值低;另一個表達率低,但MFI值高。我又作了SYBR GREEN 定量PCR,發現mRNA 的表達基本與百分比相符,而與MFI值不太一致。
個人認為如果有明顯陰性細胞群和陽性細胞群,應計算百分比;無明顯分群,僅熒光強度發生變化的應該用MFI。如果是整體峰移(或者叫單峰),那么根本不存在MFI之外的任何合理的指標,不管MFI跟其它指標吻合度如何,這就是客觀數據、客觀事實。

20、流式檢測胞內抗原時打孔液的配方?
打孔液有很多種,方法也有很多。與你的實驗方法相關。我用過酒精固定或Triton X-100(我做的都是培養的細胞):
(1)70%的酒精固定24小時即可,不再需要再打孔。如在PI染色測細胞周期或凋亡。
(2)Triton X-100是比較強烈的穿孔劑。0.1% Triton X-100/PBS(再加0.1%BSA) 是比較溫和一點。濃度可適當提高。作用時間以幾分鐘為宜。這個時間必須要自己試。時間長了細胞易破裂,短了則打孔不夠。如果你要染胞漿,則時間適當短些,如果要染內質網或核內等,由于要對兩層膜性結構打孔,時間當然會長一些
(3)可以試試0.1% saponin(皂素)

21、標本必須在抗體染色后30分內檢測嗎?
SOP是這么說的:
(1)Keep samples after staining covered with aluminum foil and at 4 0C (in the refrigerator) until they are run for flow analysis. The samples should be analyzed within 48 hours. Fluorescence loses its brightness if cells are not kept properly: not at 4 0C, or are exposed to light
(2)If cells are not fixed with paraformaldehyde, keep the samples on ice and run them immediately after staining is accomplished
因此,如果你沒有用PBS洗的話,可以用paraformaldehyde固定,放置48小時。洗了后應該盡快檢測。如果做好不能及時檢測,我們一般是加入等量的2%的多聚甲醛固定,4度冰箱避光貯存。一般過夜沒有問題,第二天同樣PBS 2ml 洗滌細胞一次,上機檢測。

22、請問流式檢測膜蛋白表達的變化用多克隆抗體出結果的機會大嗎?
流式的抗體和WB的抗體是不同的(有部分可以通用),多抗一般是大的變性蛋白為抗原制備的,而WB的中被檢測蛋白就是變性狀態,所以很吻合,而流失中一般蛋白還是保持了天然構象,所以產生的多抗可能不太好,而需要用很小特定的決定簇為抗原制備單克隆抗體。

23、在下最近作人外周血流式,作表面及其胞內染色,試劑說明書說要先分離外周血單個核細胞再染色,我有時候分的紅細胞比較多,其他的方法試過了,都改進的不好,我擔心紅細胞會有影響,想在分離出PBMC以后如果紅細胞比較多的話,就用紅細胞裂解液裂解一下,但是我有如下問題,希望這樣做過的同志指點一下,感激不禁。
(1)有人這樣在分離PBMC以后再裂解的嗎(我知道一般是在全血染色后再裂解紅細胞)?
(2)這樣會影響流式檢測嗎?
(3)用的裂解液配方是什么(最好是自己用過的)。
(4)用法是什么{我是在如果PBMC分出來以后要是紅細胞比較多的時候使用,這樣要怎樣把分出的PBMC稀釋,加多少裂解液 裂解多長時間,裂解后洗滌幾次等等}。
我曾做骨髓液分離單個核細胞而后做流式,一般來說用Ficoll分過之后即便還有紅細胞殘留,上流式也可通過%26ldquo;設門%26rdquo;根據細胞形態大小將紅細胞剔除。若紅細胞殘留太多,則可通過紅細胞裂解液進一步去除之。我用的裂解液配方是:
碳酸氫鉀(KHCO3) 1.0g
氯化氨(NH4CL) 8.3g
EDTA-Na2 0.037g 加雙H2O至1000ml,為工作液。
配好后4度冰箱保存,使用時效果更好。我是在Ficoll分過之后用的,所以一般根據離心后EP管里細胞團的大小加紅細胞裂解液,通常5ml骨髓液分離單個核細胞后得到的細胞再加500ul裂解液,震蕩混勻置2-5分鐘紅細胞就基本上裂解干凈了。洗滌次數看白細胞多少而定,因為洗的次數越多,損失就越多。我一般洗一到兩次就OK了.做了很久沒發現這樣處理影響結果。有一點,我是在這樣處理后才標記抗體的,樓上的說是標記過才溶紅細胞,所以建議在溶的時候時間不宜過長,洗滌次數也不宜過多,以免將標記上的單抗洗脫。

24、表中流式細胞儀給出的平均值是什么意思,是怎樣得到的,有些文獻中提到“fluorescence per cell”,是下面的mean值嗎,還是要用mean值除以第1欄的細胞數events,才能得到fluorescence per cell ?
mean 值就是每個細胞的平均熒光強度,不用再除細胞數。這只是個相對值,如果求絕對值,應用已知熒光劑濃度值對應儀器給出的mean值,做標準曲線。以后你得到的mean值,就可以根據這條標準曲線查出真正的熒光濃度值。

25、運用間接法流式細胞術,剛買了熒光二抗,是KPL的fluorescein-labeled affinity purified antibody to mouse IgG+IgM(H+L) produced in goat .說明說上提示要用TBS或是BSA或milk diluent/blocking solution液稀釋。稀釋至1:10~1:100。請問BSA是不是小牛血清,要用多少濃度的。TBS液我沒有,還有可否用注射用水稀釋。
BSA:牛血清白蛋白,濃度可以在一定范圍內1%~5%,具體可參考其他抗體說明書。
TBS:Tris buffer saline。就是Tris的鹽溶液,很常規的溶液,配方:20mM Tris-HCl(ph8.0),150mM NaCl。
你說的注射用水應該就是生li鹽水吧,這對抗體來說是不利的,雖然在基礎條件很差的情況下會用這個溶液,但是還不如PBS溶液。既然是做流式,按照正規程序操作抗體,得到的結果也最能反映真實情況。

26、流式細胞檢測中怎樣把對照和樣本的檢測結果放在一張圖中?
分析獲取數據是分開進行的,不可以混在一起上樣。首先通過陰性對照調節基本電壓,固定條件后進行樣品檢測,分別保存結果。利用流式軟件的multigraph中的overlap可以將陰性對照和樣品結果相應圖進行疊加,這只是獲取數據后對結果的組合和加工。
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