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如何選擇凝膠填料?科研人不能錯過!

2021-09-10 10:49 作者:洛辰 來源:上海遠慕生物試劑
做分離純化工作的人都知道,選擇合適的填料是至關重要的。通過優化組合找到高效的純化工藝,使用最少的步驟達到蛋白質產量和純度的最大化。下面看看一下填料選擇介紹。
 

1、測定-分子量、PI
當目標蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚時,可用PAGE電泳方法或層析方法加以測定。分離范圍廣闊的Superose HR預裝柱很適合測定未知蛋白的分子量。用少量離子交換介質在多個含不同PH緩沖液的試管中,可簡易地測出PI,并選擇純化用緩沖液的最佳PH。

2、選擇-層析方法
若對目標蛋白的特性或樣品成分不太了解,可嘗試幾種不同的純化方法:
1.使用最通用的凝膠過濾方法,選擇分離范圍廣闊的介質如Superose、Sephacryl HR依據分子量將   樣品分成不同組份。
2.用含專一配體或抗體的親和層析介質結合目標蛋白。亦可用各種活化偶聯介質偶聯目標蛋白的底物、受體等自制親和介質,再用以結合目標蛋白。一步即可得到高純度樣品。
3.體積大的樣品,往往使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品,可再用疏水層析純化。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理,洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用于純化流程中。

3、純化-大量粗品
處理大量原液時,為避免堵塞柱子,一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大顆粒離子交換介質。擴張柱床吸附技術利用多種STREAMLINE介質,直接從含破碎細胞或組織萃取物的發酵液中俘獲蛋白。將離心、超濾、初純化結合為一。提高回收率,縮短純化周期。

4、純化-硫酸氨樣品
硫酸氨沉淀方法常被用來初步凈化樣品,經處理過的樣本處于高鹽狀態下,很適合直接上疏水層析。若作離子交換,需先用Sephadex G-25脫鹽。疏水層析是較新技術,隨著介質種類不斷增多,漸被融入各生產工藝中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八種疏水介質中選擇最適合介質及最佳的純化條件。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。

5、純化-糖類分子
固化外源凝訂素如刀豆球蛋白、花生、大麥等凝集素,可結合碳水化合物的糖類殘基,很適合用作分離糖化細胞膜組份、細胞、甚至亞細胞細胞器,純化糖蛋白等。兩種附上外源凝集素的Sepharose 6MB親和層析介質,專為俘獲整個細胞或大復合物,如膜囊等。

6、純化-膜蛋白
膜蛋白分離常使用去污劑以保持其活性。離子性去污劑應選用與目標蛋白相反電荷者,避免在作離子交換時和目標蛋白競爭交換介質,籍此除去去污劑。非離子性去污劑可以疏水層析除去。

7、純化-單抗、抗原
單抗多為IgG。來源主要是腹水和融合瘤培養上清液。腹水有大量白蛋白、轉鐵蛋白和宿主抗體等。Mabselect、Protein G和Protein A對IgG的Fc區有專一性親和作用,能一步純化各種不同源的IgG。血清互補劑如小牛血清可先用蛋白G預處理,在培養前除去IgG。重組蛋白A介質Mabselect和rProtein A Sepharose FF對IgG有更高的載量和專一性,基團脫落更少。脫落的rProtein A用離子交換Q Sepharose HP或凝膠過濾Superdex 200,很容易去除。
疏水層析Phenyl Sepharose HP亦很適合純化IgG。宿主抗體和污染IgG可用凝膠過濾Superdex 200在精細純化中去除。
純化IgG抗原最有效的方法是用活化偶聯介質如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶聯IgG,再進一步獲取IgG抗原。
HiTrap IgM是用來純化融合瘤細胞培養的單抗IgM,結合量達5mg IgM。HiTrap IgY是專門用來純化IgY,結合量達100mg純IgY。

8、純化-重組蛋白
1.重組蛋白在設計、構建時應已融入純化構想。樣品多夾雜了破碎細胞或溶解產物,擴張柱床吸附技術STREAMLINE便很適合做粗分離。Amersham biosciences提供三個快速表達、一步純化的融合系統。
GST融合載體使要表達的蛋白和谷胱甘肽S轉移酶一起表達,然后利用Glutathione Sepharose 4B作親和層析純化,再利用凝血酶或因子Xa切開。
2.蛋白A融合載體使要表達的蛋白和蛋白A的IgG結合部位融合在一起表達,以IgG Sepharose 6 FF純化。
含組氨酸標記(Histidine-tagged)的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金屬,在一般或變性條件(8M尿素)下透過組氨酸螯合融合蛋白。HisTrap試劑盒提供整套His-Tag蛋白的純化方法。

9、純化-包涵體蛋白
包涵體蛋白往往需溶于6M鹽酸胍或8M尿素中。高化學穩定性的Superose 12及Sepharose 6FF凝膠過濾介質很適合在變性條件下做純化。變性純化后的蛋白需要復性至蛋白的天然構象。Superdex 75、Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分別被發現有助包涵體蛋白的復性。一般包涵體蛋白樣品的純度越高,復性效果越好。SOURCE 30 RPC反相層析介質很適合純化復性前的粗品,并可以1MnaOH重生。此方法純化后的包涵體蛋白,復性回收率明顯提高。

10、包涵體蛋白固相復性
近年許多文獻報導將包涵體蛋白在變性條件下固定(吸附)在層析介質上,一般用各種Sepharose FF離子交換層析介質。去除變性劑后,蛋白在介質上成功復性,再將復性好的蛋白洗脫下來。固相復性避免了一般復性過程中蛋白質聚體的形成,所以復性得率更高,而且無需大量稀釋樣品,并將復性和初純化合二為一,大大節省時間及提高回收率。

固相復性方法也被用于以HiTrap Chelating金屬螯合層析直接復性及純化包涵體形式表達的組氨酸融合蛋白;以HiTrap Heparin肝素親和層析直接復性及純化包涵體形式表達的含多個賴氨酸的融合蛋白。兩種親和層析預裝柱均可反復多次重復使用,比一般試劑盒更方便、耐用。

11、純化-中草藥有效成分
中藥的化學成分極其復雜。傳統中藥多是煎熬后服用,有效成份多較為親水,包括生物堿、黃酮、蒽醌、皂甙、有機酸、多糖、肽和蛋白質。靈活及綜合性地利用多種層析方法。如離子交換、分子篩、反相層析,更容易分離到單一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝膠同時具備吸附性層析和分子篩功能,例:如用甲醇分離黃酮甙,三糖甙先被洗下來,二糖甙其次,單糖甙隨后,最后是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各種試劑,廣泛用于各種天然產物的分離,包括生物堿、甙、黃酮、醌類、內脂、萜類、甾類等。

*生物堿在酸性緩沖液中帶正電,成為鹽,HiTrap SP陽離子交換層析柱可以分離許多結構非常近似的生物堿。相反,黃酮、蒽醌、皂甙、有機酸等可溶于偏堿的緩沖液中,在HiTrap Q陰離子交換柱上分離效果良好。

*一般多糖純化大多使用分子篩如Sephadex,Sephacryl。若分子量在600KD以下,并需更高分辨率,可選擇新一代的Superdex。一般植物可能含水溶性、酸溶性、堿溶性多種多糖。綜合利用分子篩及離子交換層析有助進一步獲各組份純品。另外,多糖藥物需去除可引起過敏的蛋白質,傳統Sevag方法用丁醇脫蛋白需反復數十次。陰陽離子交換法可以一、兩步快速去除多糖中殘存的蛋白質。SOURCE5、15、30RPC反相層析也很適合各種中藥有效成分的檢測、分離和放大制備。由于中藥的成分非常復雜,SOURCE反相層析可用范圍為PH1-14 ,并可用1M NaOH,1M HCL清洗、再生。比傳統硅膠反相層析更易于工藝優化及在位清洗,壽命也更長。

12、純化-肽類
肽類的來源有天然萃取,合成肽和重組肽三種。肽容易被酶降解,但可從有機溶劑或促溶劑中復性,所以多以高選擇性的反相層析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或離子交換Minibeads、Monobeads作純化。Superdex Peptide HR是專為肽分子純化設計的凝膠過濾預裝柱,能配合反相層析做出更精美的肽圖。肽分子制備可用離子交換配合凝膠過濾Superdex 30 PG。

13、純化-核酸、病毒
核酸的純化用于去除影響測序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分為質粒DNA、噬菌體DNA和PCR產物等。病毒也可視作核酸大分子,和質粒DNA一樣,可用分離大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝膠過濾介質去除雜蛋白,再配合離子交換如Mono Q、 SOURCE Q分離核酸。

14.純化-寡核苷酸
寡酸苷酸多應用在反義(anti-sense)DNA、RNA測序、PCR和cDNA合成等研究。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以陰離子交換的Mono Q或快速低反壓的SOURCE Q在PH12下可除副產物,并避免凝集和保護基的脫落。載量大大高過反相層析,可用做大量制備。不含三苯甲基的失敗序列可用反相柱ProRPC去除。

15.脫鹽、小分子去除
使用凝膠過濾介質Sephadex G10,G15,G25,G50等去除小分子,效率高,處理量可達床體積30%。只需在進樣后收集首1/3-1/2柱體積的洗脫液,就可以去除該填料分離范圍上限以下的小分子,簡單直接。由于只是去除小分子,柱高10cm以上即可。整個過程一般可于數分鐘至半小時完成。Sephadex G25系列介質專為蛋白質脫鹽而設計,預裝柱HiTrap Desalting(5ml)可用針筒操作。HiPrep Desalting(26ml)可在數分鐘為多至10ml樣品脫鹽。

16、疫苗純化
使用凝膠過濾介質Sepharose 4FF純化疫苗,去除培養基中的雜蛋白,處理量可大于床體積10%。柱高一般40-70cm,整個過程約半至一小時。目前使用此法生產的疫苗品種有乙肝、狂犬、出血熱、流感、肺結核、小兒麻痹疫苗等。分子量較小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR,如甲肝疫苗等。

在下游純化中,可應用不同層析技術在純化生物分子的同時,去除各種污染物。

1、去除-內毒素
內毒素又稱熱原。含脂肪A、糖類和蛋白,是帶負電的復合大分子。
內毒素的脂肪A部份有很強的疏水性。但在高鹽下會凝集,無法上疏水層析。利用疏水層析試驗盒可選擇結合目標蛋白的介質而去除內毒素。
內毒素與陰離子交換介質Q或DEAE Sepharose Fast Flow有較強結合??稍谙疵撃繕说鞍缀笥酶啕}緩沖液或NaOH去除。
利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶聯內毒素底物如LAL,PMB,自動成親合層析介質結合內毒素。內毒素經常是多聚體,凝膠過濾層析可有效地將之去除。

2、去除-蛋白中的核酸
大量核酸增加樣本黏度,令區帶擴張,反壓增加,降低分辨率和流速。藥審和食檢對核酸含量也有嚴格限制。
胞內表達蛋白的核酸問題尤其嚴重。核酸帶陰電荷,在初步純化時利用陽離子交換介質如STREAMLINESP,SP Sepharose Big Beads,SP或CM Sepharose FF,SP SepharoseXL結合目標蛋白,可除去大量核酸。
核酸在高鹽下會和蛋白解離,疏水層析介質很適合用來結合目標蛋白,在純化蛋白的同時去除核酸。
利用核酸酶將核酸切成小片斷,用凝膠過濾做精細純化時便很容易去除了。

3、去除-病毒和微生物
病毒和微生物可成為病原,應盡量減除。結合不同層析技術,使用注射用水,用NaOH定期進行儀器和凝膠的在位消毒和在位清洗,皆可避免污染物增加。
病毒大都有脂外殼??捎门c目標蛋白電荷相反的S/D(solvent/detergent)處理,使病毒失活,如Triton和Tween。再用適當的離子交換介質如CM Sepharose FF結合目標蛋白,去除S/D。
其它污染物可以改變pH和離子強度使其從目標分子中解離或失活,凝膠過濾介質Superdex及多種吸附性介質,SOURCE都是很好的精細純化介質,可去除多種微量污染物。
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