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細胞培養的具體步驟,老生常談了!

2021-09-10 10:24 作者:洛辰 來源:上海遠慕生物試劑
具體步驟:
1、細胞復蘇
將凍存細胞從液氮中取出后,在37℃水浴鍋內不斷搖動促進其融化。將融化的細胞移入離心管中,加入37oC預熱的DMEM完全培養基中(其中胎牛血清約為10%),輕輕吹勻,離心,500g離心2min,棄上清液。加入DMEM完全培養基清洗,棄上清液。
加入DMEM完全培養基,輕輕吹打混勻,制成細胞懸液,接種于培養皿/瓶中,在含5% CO2的細胞培養箱中培養。

2、細胞傳代
當細胞密度達到80%~90%(過早產量不足,過晚細胞狀態不佳,1:2至1:10以上的比率傳代培養,一般1:3至1:5細胞一代,即從細胞接種到分離再培養的一段時間,非細胞有絲分裂次數)時,去掉完全培養基,用1X PBS清洗2次。
加入胰蛋白酶(注意:消化液的量以蓋住細胞最好,最佳消化溫度是37oC。顯微鏡下觀察細胞:倒置顯微鏡下觀察消化細胞,若胞質回縮,細胞之間不再連接成片,表明此時細胞消化適度)進行消化,放入細胞培養箱中約2-3min。
加入適量DMEM完全培養基終止胰蛋白酶消化,轉移至離心管后500g離心2min,棄上清液,再加入DMEM完全培養基清洗,棄上清液。
加入DMEM完全培養基,輕輕吹打混勻,吸取10微升進行計數,然后按照所需細胞量在含5% CO2的細胞培養箱繼續培養。

3、細胞凍存
當細胞密度達到80%~90%時,去掉完全培養基,用1X PBS清洗2次。加入胰蛋白酶進行消化,放入細胞培養箱中約2-3min。加入DMEM完全培養基終止胰蛋白酶消化,轉移至離心管后500g離心2min,棄上清液,再加入DMEM完全培養基清洗,棄上清液。加入lml凍存液(90%胎牛血清,10% DMSO。
一般來講血清含量可以在10%-90%之間調整,凍存液中加入血清一方面可以為細胞提供營養,另一方面可以在細胞凍存過程中提供非滲透性保護物質,如蔗糖,白蛋白等從而更好地保護細胞),放入凍存管內(管內有異丙醇,以保證溫度降低的速度),立即放入4oC冰箱中凍存30min,然后放入-20oC冰箱中凍存30min,再置于-80℃冰箱內過夜。第二天放入液氮中,可以保存至少兩年,如不放人液氮,可以保存三個月。
細胞凍存和復蘇的原則是:慢凍速融,這樣更加有利于保持細胞的活力。凍存細胞不加任何保護劑,會導致細胞內冰晶的產生,從而使細胞產生內源性的機械損傷,引起細胞內環境滲透壓,PH,電解質等的改變,進而促使細胞死亡。

4、注意事項
(1)預熱培養用液:把已經配制好的裝有培養液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱
(2)用75%酒精擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手;
(3)正確擺放使用的器械:保證足夠的操作空間,不僅便于操作而且減少污染;
(4)點燃酒精燈:注意火焰不能太??;
(5)嚴格的無菌操作;
(6)貼壁細胞消化適度:消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響,消化過程中應該注意培養細胞形態的變化,一旦胞質回縮,連接變松散,或有成片浮起的跡象就要立即終止消化;
(7)傳代細胞所有的操作盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進行一種細胞的操作,每種細胞使用一套器材。避免交叉感染;
(8)傳代細胞瓶口每次打開或者關閉都需要在酒精燈上消毒。
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