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你還不能區分蛋白互作的幾種方法嗎?

2021-09-09 11:41 作者:洛辰 來源:上海遠慕生物試劑
理論知識點看了千千萬,但是還是容易混淆概念傻傻分不清IP,Co-IP,GST-Pull Down,本文我們不止放送有IP與Co-IP區別知識要點,而且也將研究蛋白互作幾種方法(酵母雙雜交系統(Y2H),CO-IP的關系,GST-Pull Down)之間的區別以及優缺點簡明扼要的收納進來,看了這篇文章你還不能區分IP,Co-IP,GST-Pull Down你就來打我。話不多說,看下文:

獨角戲——IP:
免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)就是用偶聯相應抗體的磁珠把你要研究的蛋白X免疫沉淀下來,然后去檢測它。例如蛋白X在細胞內的蛋白量不同,或者有著不同的翻譯后修飾,這時就可以用X蛋白抗體+Prorein A beads來進行IP,從細胞中把蛋白X拉下,再用特異的抗體(如磷酸化,泛素化抗體)進行WB來檢測蛋白X的變化。簡言之,IP就是檢測單個蛋白的狀態(高矮胖瘦,有沒有戴帽子,穿的什么衣服等等)。
眾里尋她千百度——酵母雙雜交系統(Y2H):

酵母雙雜交系統的建立是基于對真核生物轉錄調控過程的認識。真核生物中基因轉錄需要轉錄激活因子的參與,真核生物的轉錄激活因子含有兩個不同的結構域:DNA 結合結構域(DNA binding domain,DNA-BD)和DNA轉錄激活結構域(Activation domain,AD),這兩個結構域可以獨立分開,功能互不影響。BD和AD分別單獨作用并不能激活轉錄反應,只有當二者在空間上充分接近時,才呈現完整的轉錄激活因子活性,使下游基因得到轉錄。根據這一原理,可設計酵母雙雜交系統。

將兩待研究蛋白(蛋白 X 與蛋白 Y)分別與 BD、AD 結構域構建融合質粒。將構建好的兩個質粒轉入同一酵母細胞中表達,如果兩蛋白之間不存在相互作用,則下游基因(報告基因)不會轉錄表達;如果兩個蛋白間存在相互作用,則BD與AD兩結構域空間上很接近,從而下游基因(報告基因)得以轉錄。通過報告基因表達與否,即可判斷兩蛋白之間是否存在相互作用。

通常在現實情況中,與蛋白X存在潛在互作可能的候選蛋白會有好幾種(Y,Z,A,B等),這時我們就可以通過酵母雙雜交在體內篩選與X有相互作用的蛋白Y。

遇見愛情——Co-IP:

竟然我們在體內驗證過,那么蛋白X和蛋白Y在體外是否也存在相互作用了?這個時候我們可以用到Co-IP了~

免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)的原理和IP是一樣的,當細胞在非變性條件下被裂解時,完整細胞內存在的許多蛋白質-蛋白質相互作用被保留了下來,假如細胞內存在 XY 蛋白復合物,用 X(X也稱為誘餌蛋白)的抗體免疫沉淀 X,那么與

X 在體內結合的蛋白質 Y(Y也稱為靶蛋白)也被沉淀下來。因此在細胞裂解液中加入 X 的抗體沉淀蛋白X,隨后利用蛋白印跡(western blot,WB)檢測沉淀中是否存在蛋白 Y,如果存在,則說明細胞內存在XY蛋白復合物,即蛋白XY存在相互作用。(在體外驗證X和Y之間有聯系)


在我們用酵母雙雜交和Co-IP雙保險驗證X和Y之間確實存在相互作用后,我們發現酵母雙雜交和Co-IP的結果都只能說明X和Y之間有相互作用,但并不能確定這種相互作用是直接的還是間接的,這個時候存在兩種可能:

X與Y之間存在直接的相互作用(X和Y自由戀愛一見鐘情)

也就是說也許是X與M相互作用,而Y也和M相互作用,這樣,用A的抗體可以把M拉下來,但同時M又把B也拉下來了(X和Y是通過他們共同的朋友M介紹才認識然后在一起的)


要想準確確定X和Y直接的作用到底是直接的還是間接的了,這個時候我們需要祭出我們大boss——GST-Pull Down實驗~

GST-Pull Down:GST-Pull down實驗是一個行之有效的驗證酵母雙雜交系統的體外試驗技術, 近年來越來越受到廣大學者的青睞。

原理:將靶蛋白和GST組成的融合蛋白固定在谷胱甘肽(GSH)親和樹脂上,作為與目的蛋白親和支撐物,充當一種“誘餌蛋白”,目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白),洗脫結合物后通過SDS-PAGE電泳分析,從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白,“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統以及體外轉錄翻譯系統等方法獲得,此方法簡單易行,操作方便。
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