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慢病毒載體,就這么實用!

2021-09-09 11:27 作者:洛辰 來源:上海遠慕生物試劑
慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎發展起來的基因治療載體。區別一般的逆轉錄病毒載體,它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。

慢病毒載體的研究發展得很快,研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞,從而達到良好的的基因治療效果,在美國已經開展了臨床研究,效果非常理想,因此具有廣闊的應用前景。
 


一、應用

慢病毒載體的研究發展得很快,研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞,從而達到良好的的基因治療效果,在美國已經開展了臨床研究,效果非常理想,因此具有廣闊的應用前景。

慢病毒也被廣泛地應用于表達RNAi的研究中。由于有些類型細胞脂質體轉染效果差,轉移到細胞內的siRNA半衰期短,體外合成siRNA對基因表達的抑制作用通常是短暫的,因而使其應用受到較大的限制。采用事先在體外構建能夠表達siRNA的載體,然后轉移到細胞內轉錄siRNA的策略,不但使脂質體有效轉染的細胞種類增加,而且對基因表達抑制效果也不遜色于體外合成siRNA,在長期穩定表達載體的細胞中,甚至可以發揮長期阻斷基因表達的作用。

1.載體

慢病毒載體(Lentiviral vector)較逆轉錄病毒載體有更廣的宿主范圍,慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細胞。慢病毒載體能夠產生表達shRNA的高滴度的慢病毒,在周期性和非周期性細胞、干細胞、受精卵以及分化的后代細胞中表達shRNA,實現在多種類型的細胞和轉基因小鼠中特異而穩定的基因表達的功能性沉默,為在原代的人和動物細胞組織中快速而高效地研究基因功能,以及產生特定基因表達降低的動物提供了可能性。慢病毒作為siRNA的攜帶者,不但具備特異性地使基因表達沉默的能力,而且充分發揮了慢病毒載體自身所具備的優勢,為基因功能的研究提供了更強有力的工具。

慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上,從而達到持久性表達目的序列的效果。對于一些較難轉染的細胞, 如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等,使用慢病毒載體,能大大提高目的基因或目的shRNA的轉導效率,且目的基因或目的shRNA整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加,能夠比較方便快捷地實現目的基因或目的shRNA的長期、穩定表達。

2.表達載體

慢病毒表達載體,即通常所說的穿梭載體,包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質??商峁┧械霓D錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒,需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞,在細胞中進行病毒的包裝,包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中,離心取得上清液后,可以直接用于宿主細胞的感染,目的基因進入到宿主細胞之后,經過反轉錄,整合到基因組,從而高水平的表達效應分子。

二、特征比較

常用的病毒載體有腺病毒、逆轉錄病毒和慢病毒。逆轉錄病毒載體只能感染分裂期細胞,而且容量有限,腺病毒一般不能整合到染色體上,只能進行瞬時感染。與其它逆轉錄病毒相比,慢病毒(LV)具有可以感染非分裂期細胞、容納外源性基因片段大,可以長期表達等顯著優點。慢病毒不產生任何有效的細胞免疫應答,可作為一種體外基因運輸的工具。慢病毒載體介導的轉基因表達能持續數月,且無可觀察到的病理學現象。

慢病毒包裝系統一般由慢病毒表達載體和慢病毒包裝載體組成。

而慢病毒包裝質??商峁┧械霓D錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒,需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞,在細胞中進行病毒的包裝,包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中,離心取得上清液后,可以直接用于宿主細胞的感染。

慢病毒包裝系統一般都是三質?;蛩馁|粒包裝系統。其中四質粒系統比三質粒系統在生物安全性上更好一些,所以應用較多。

三、目的與意義

1.對于一些較難轉染的細胞,如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等,能大大提高目的基因轉導效率,而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加,這就為RNAi,cDNA 克隆以及報告基因的研究提供了一個有利的途徑。
2.進行穩轉細胞株的篩選。
3.為活體動物模型實驗提供高質量的包含目的基因的病毒液

四、相關實驗

1.實驗目的
對于一些按常規方法難以轉染甚至無法轉染的細胞,通過病毒介導的實驗能夠大大提高基因的轉導效率,以達到目的基因的高效瞬時表達。

2.實驗流程
1.根據目的基因相關信息(序列,序列號等),構建含有外源基因或siRNA的重組載體;
2 .對于測序正確的重組質粒,提取和純化高質量的不含內毒素的重組質粒;
3.使用高效重組載體和病毒包裝質粒共轉染293T 細胞,進行病毒包裝和生產,收集病毒液;
4.濃縮、純化病毒液;
5.用高質量的病毒液感染細胞;
6.通過定量PCR精確測定病毒滴度(高精確滴定方法)和Western 分析實驗結果;
7.用高質量的病毒液感染宿主細胞;檢測基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用藥物進行穩定轉染細胞株的篩選,通常狀況下,篩選的細胞克隆株具有長期的表達穩定性。病毒液足夠用于一般的動物活體實驗。
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