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單細胞測序前期常見問題解答

2021-09-07 11:46 作者:洛辰 來源:上海遠慕生物試劑
目前,單細胞測序這項技術被應用的越來越多,領域包括了神經科學、腫瘤免疫、胚胎發育等等,您是否也計劃著開展相關的研究呢?心中關于單細胞的疑惑就讓遠慕生物帶您從常見問題出發,逐步撥開迷霧吧。
 

1、為什么要做單細胞測序?

細胞與細胞之間的異質性,微環境里的細微差別,這些我們關注的信息都會被常規Bulk測序所掩蓋,而單細胞水平可以將細胞一一分開,找到差異。單細胞測序首次將我們的研究拋開上帝視角,深入到細胞內部,觀察每一個細胞的差別和相似,除了基因層面,我們也可以在細胞層面和細胞類群層面進行多維度的解析。

2、單細胞測序對送樣有什么要求?

制備好的單細胞懸液或血液、組織均可,質量要求:細胞活性大于80%,細胞濃度介于5*10^5—1.2*10^6/ml,細胞總數最好大于10^5個,細胞培養基及緩沖液不能含Ca2+和Mg2+,細胞體積需小于40μm,大于5μm。不同物種、不同組織,包含的細胞類型多種多樣。針對同一個組織,根據研究的生物學問題,對不同細胞類別的需求也是千差萬別。派森諾的單細胞懸液制備研發團隊,針對不同的物種、不同的組織類型、不同的實驗處理方式、不同的感興趣的細胞類型設計一對一高度個性化的解離方案。取樣細節、運輸細節,方方面面,為您高度個性化的研究保駕護航。

3、細胞懸液的制備過程中是否會影響基因的表達?

目前常用的方法中,不管是酶消化還是機械操作都會不可避免的對細胞產生影響,前者會使細胞產生應激反應,后者則容易損傷細胞,進而影響細胞活性。所以,在單細胞測序實驗設計時,設置對照是非常重要的。前述的這些影響,在case和control中同樣存在,我們關注case和control的差異表達基因,就可以去除實驗的系統誤差,找到決定感興趣生物學過程的關鍵基因。

4.、10XGenomics單細胞平臺有什么優勢?

一.細胞通量高,一次可捕獲上萬細胞 ;

二.對細胞大小及類型限制低,且捕獲效率高達65% ;

三.性價比高,且從懸液到文庫構建周期短。

5、如何判定數據質量?

拿到一個高質量的數據,第一步是需要獲得高質量的單細胞懸液。單細胞懸液的細胞活性,要求大于80%。目前常用的是AO/PI染色和臺盼藍染色法。相比較而言,臺盼藍染色會有一定的假陰性。針對用臺盼藍染色做的植物原生質體的活性測定,假陰性的比例會更高。因為富含葉綠體的植物細胞在臺盼藍染色后顏色更深,細胞計數儀會被判定為死細胞。因此,經驗豐富的操作人員檢查細胞狀態,也是非常重要的一步。第二步是需要捕獲到足夠數量的高質量的細胞。關于這一點的質控標準,可結合下圖做個闡釋。

1、捕獲到的細胞數量:這是單細胞測序研究的重要參數。捕獲到的細胞數量越多,證據越充分,越有利于發表高分文章。在后續分析過程中,會再做一次細胞過濾,最終得到的細胞數目,即是每一篇單細胞測序文章都會描述的捕獲到的細胞數目。

2、是細胞中的平均reads數,相當于測序深度,一般大于3萬是比較好的數據。

3、是細胞中的中位基因值,該值的大小與不同的組織樣本有關,如癌細胞中可能數值較高。

4、是測序的飽和度,一般大于50%即可。

5、是本次測序得到的reads比對到高質量細胞的占比,也是后續用來分析的數據。如果細胞活性偏低,細胞破裂較多,游離到環境中的mRNA偏多,這個數值會偏低。

6、如何判斷細胞類型?

細胞類型的判斷是需要您自己選擇Marker基因的,您可以參考同類物種或樣本的已發表文章,或者根據數據庫去確定Marker,比如CellMarker,panglao等。

細胞是生命活動的基本單位,而如今科技的發展讓我們有能力有機會去對它進行探索,去一展它的全貌,去窺探復雜生命背后的深層機制,我們相信在未來較長的一段時間內,隨著單細胞測序的發展及數據的積累,關于表型、基因型與環境之間的脈絡會越來越清晰,讓我們能更加深入的了解自然了解自己。
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