<ruby id="lnzp1"><dl id="lnzp1"></dl></ruby>
<span id="lnzp1"></span>
<strike id="lnzp1"><dl id="lnzp1"></dl></strike>
<strike id="lnzp1"><dl id="lnzp1"></dl></strike>
<strike id="lnzp1"></strike>
<span id="lnzp1"><dl id="lnzp1"></dl></span>
<span id="lnzp1"></span>
<span id="lnzp1"><video id="lnzp1"><strike id="lnzp1"></strike></video></span>
<strike id="lnzp1"></strike>
<span id="lnzp1"></span>
<strike id="lnzp1"><video id="lnzp1"></video></strike>
<strike id="lnzp1"></strike>
<th id="lnzp1"><video id="lnzp1"></video></th>
<span id="lnzp1"></span>
<span id="lnzp1"><i id="lnzp1"><del id="lnzp1"></del></i></span>
<ruby id="lnzp1"><dl id="lnzp1"></dl></ruby>
<strike id="lnzp1"><dl id="lnzp1"></dl></strike>
<strike id="lnzp1"></strike><span id="lnzp1"></span>
歡迎來到上海遠慕生物科技有限公司官方網站!
021-50760790

蛋白樣品在跑膠前要如何處理

2021-09-07 11:24 作者:洛辰 來源:上海遠慕生物試劑
一、蛋白樣品制備

之前和大家介紹過細胞和組織蛋白質的提取,當我們做WB的時候,需要對提取好的蛋白樣品進行處理:在蛋白樣品中加入SDS loading buffer 6X(蛋白上樣緩沖液)稀釋至1X(如蛋白樣品有120ul,則加入SDS loading buffer 6X 600ul),混勻,75-95度加熱10-15分鐘,使蛋白變性以充分暴露抗原位點。在加熱結束后,進行離心,使蛋白樣品適當降溫,防止PAGE膠被融化。

PS:要測量的蛋白如果是磷酸化形式,一般加熱到75度,一般情況可95度加熱。市面上買到的SDS loading buffer 有2X的也有5X的,最后稀釋至1X即可。

那么為什么我們加入SDS loading buffer呢?主要就是用它的不同成分在電泳中起了關鍵的作用。

SDS loading buffer 的主要成分及作用:A:0.1%溴酚藍,作為指示劑,方便觀察電泳進行的程度;B:10%甘油,密度大,增加樣本的重量,可攜帶樣本沉到底部;C:2%SDS,是一種陰離子表面活性劑,能打斷蛋白質的氫鍵和疏水鍵,按一定比例和蛋白質分子結合成為復合物,是蛋白質帶滿負電荷,從而是蛋白帶電荷一致,減少電荷對電泳結果的影響;D:巰基乙醇還原劑,使蛋白質的二硫鍵斷開,使得蛋白保持線性結構。


二、蛋白上樣

1. 將之前配好的膠固定在電泳裝置上,加入1X電泳液

2. 拔出梳子,應該兩側同時用力,緩慢拔出,注意在拔除梳子時防止氣泡進入梳孔使其變形,若上樣孔有變形,可用適當粗細的針頭撥正。

3.加入蛋白樣品,一般10孔的梳孔,每孔可以加入20ul  -40ul蛋白樣品,15孔的梳孔,每孔可以加入10ul  -30ul蛋白樣品,是用微量注射器加樣,平時我們也可以用普通的移液槍加樣,盡量讓槍頭深入梳孔底物,防止蛋白樣品飄出,一般在目的蛋白兩側加入等量的marker,如果兩側有空的梳孔,應該加入1X的loading buffer,起“壓邊”作用,可以使蛋白樣品在一條水平線上往下跑。

4.電泳:接上電極,正負極不要弄反,紅色對紅色,黑色對黑色,初始電壓設為90V,當樣品跑至分離膠時將電壓調至120V,一般在溴酚藍跑出膠時停止電泳,也可根據目的蛋白的分子量來選擇跑的時間,如分子量較大,可以延長電泳時間,使得分子量大的marker跑的分散開,容易判斷分子量。

三、注意事項

1.蛋白樣品上樣量最好相等,不要過多。

2.不要過多重復使用電泳Buffer

3.最佳分辨區在分離膠的2/3

4.電泳后測定的分子量有10%的誤差,不可完全信任。有些蛋白質由亞基(如血紅蛋白)或兩條以上的肽鏈(α-胰凝乳蛋白酶)組成的,它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈,SDS-PAGE電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量,有的蛋白質(如電荷異?;蚪Y構異常的蛋白質,帶有較大輔基的蛋白質)不能采用該發測相對分子量。

5.如果電泳中出現拖尾,染色帶的背景不清晰等現象,可能是SDS不純引起。
收縮
QQ咨詢
  • 標準品
電話咨詢
  • 銷售一:18321664727
  • 銷售二:13310162040
  • 銷售三:18001933641
郵箱咨詢
  • [email protected]
少妇深喉口爆吞精视频无码_免费国产亚洲视频在线播放_老少配老妇老熟女中文普通话_在线观看国产午夜福利片汤唯