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單核細胞分離原理、方法及要點

2021-09-07 9:13 作者:洛辰 來源:上海遠慕生物試劑
基本原理:
本文分離單核細胞所用方法是Percoll非連續性密度梯度離心法,主要是根據不同細胞間密度的差別進行細胞分離。此法易操作,且使用通常的實驗設備即可完成。

試劑與器材
1)外周血單個核細胞
2)1×PBS和10×PBS(無Ca2+、Mg2+,0.5mM EDTA),胎牛血清(56℃,30分鐘加熱滅活),HCl 1mol/L。
Percoll分層液(密度=1.130g/ml,商品),4g/L臺盼藍染液(溶解在PBS液中)。
3)50ml聚丙烯圓錐管,毛細吸管,移液管(1、2、10ml)。
4)CO2孵箱,超凈臺,有旋轉桶轉子裝置的離心機,PH計。

操作步驟——所有的操作應該在無菌條件下進行
(一)不同密度Percoll分層液的配制
1.Percoll分層液儲備液的制備:取未稀釋的Percoll原液(從瓶中?。?ml+1ml 10×PBS (無Ca2+、Mg2+),用HCl 調節PH至7.4
2. Percoll分層液(Ⅰ)(密度=1.080g/ml)的配制:取Percoll儲備液3.12 ml(前一步配制)+1.88 ml 1× PBS1(無Ca2+、Mg2+)
3. Percoll分層液 (Ⅱ)(密度=1.069g/ml)的配制:取Percoll分層液(Ⅰ)2.68 ml+2.32ml 1×PBS( 無Ca2+、Mg2+)
4. Percoll分層液(Ⅲ)(密度=1.060g/ml)的配制:取Percoll分層液(Ⅱ)2.32 ml +2.68 ml 1×PBS(無Ca2+、Mg2+)

(二)不連續密度梯度制備
1. 將洗滌過的8×107外周血單個核細胞重新懸浮在2ml的Percoll分層液(Ⅰ)(密度=1.080g/ml)在這層液體的表面上輕輕鋪上2ml Percoll分層液(Ⅱ)(密=1.069g/ml),后再于第二層液面上輕輕鋪上2ml的Percoll分層液(Ⅲ)(密度=1.060g/ml)
2. 20℃,在旋轉轉子中1000×g離心上步所形成的密度梯度90分鐘(慢慢增加速度,無制動停轉)。

(三)單核細胞的分離
1. 離心后單核細胞存在于Percoll分層液(Ⅱ)和(Ⅲ)(密度較小的部分)之間的界面中。
2. 用毛細吸管仔細收集單核細胞。
3. 用含1-5%胎牛血清的 1×PBS液洗滌細胞3次,4℃,400×g離心5分鐘,棄上清液。
4. 若需要進一步實驗,將細胞重新懸浮于培養基中。
5. 用臺盼藍拒染法測定細胞存活率。
結果:本法回收的細胞中單核細胞占70-100%(存活率應大于90%),淋巴細胞占0-20%,粒細胞占0-5%,紅細胞占0-7%,血小板小于0.5%。

實驗要點
1.為了得到較好的結果,外周血單個核細胞分離后應立即使用。
2.所有操作過程應在18-20℃中進行。
3.仔細覆蓋各種Percoll分層液,避免破壞其界面。
4.洗滌分離細胞3次,以除去殘存的Percoll分層液和血小板。
5.如果所制備的細胞仍不純,可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗體分子的磁珠, 以除去殘存的NK、T、B淋巴細胞。
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