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神經HRP示蹤顯色液(DAB法)操作步驟

2021-09-06 14:24 作者:洛辰 來源:上海遠慕生物試劑
產品名稱:神經HRP示蹤顯色液(DAB法)
規格:50T
分類:神經染色
儲存條件:4℃,避光,6個月
用途:神經HRP示蹤DAB(四甲基聯苯胺)顯色。
注意事項:主要由DAB孵育液、雙氧水、乙酸鈉緩沖液等組成,染色后呈棕色。

簡介:上個世紀70年代,Kristensopn和Olsson報道了HRP可經神經末梢攝取,經軸漿逆行運輸至神經元胞體,經組織化學方法可顯示出神經元的輪廓,從而開發出HRP追蹤神經元示蹤技術,即為HRP法。DAB即3,3N-DiaminobenzidineTertrahydrochloride,是辣根過氧化物酶的常用底物。在辣根過氧化物酶的催化下,DAB會產生棕色沉淀,該棕色沉淀不溶于水和乙醇,顯色后呈棕色,可在顯微鏡下觀察。神經HRP示蹤顯色液(DAB法)是動物經麻醉、注入HRP后,游離或絡合型的HRP不氧化劑反應生成絡合物,該絡合物氧化供氫的DAB顯色劑,呈棕色,在顯微鏡下清晰可見。該顯色液僅用于科研領域,不宜用于臨床診斷或其他用途。

操作步驟(僅供參考):
(一)、準備工作
1、動物麻醉:多用(3.5%)戊巴比妥鈉作為麻醉劑,大鼠的麻醉劑量為0.25-0.35ml/100g。
2、導入HRP:有壓力注射法、電泳法以及周圍神經系統的注射涂抹等法。
3、確定動物存活期。
4、動物灌注:麻醉后,經左心室升主動脈插管行心內灌注固定。先用生理鹽水或PBS快速灌注。隨后用4%的多聚甲醛固定液灌注,先快后慢,時間控制在30-40min。最后用10%蔗糖磷酸緩沖液(pH7.4)。
5、取材:取組織置于20%的蔗糖磷酸鹽緩沖液中,切片厚度40μm,存于蔗糖磷酸鹽緩沖液備用。

(二)、顯色反應
1、配制DAB孵育液:取適量的DABassaybuffer和DAB顯色液,按DABassaybuffer:DAB顯色液=39:1的比例混合,即為DAB孵育液,即配即用,不宜保存。
2、配制DAB顯色工作液:取適量的DAB孵育液和DAB增強劑,按DAB孵育液:DAB增強劑=2000~8000:1的比例混合(具體比例應根據具體時間摸索確定),即為DAB顯色工作液,即配即用,不宜保存。
3、配制1×DABWashbuffer:取適量的DABWashbuffer(20×),按DABWashbuffer:蒸餾水=1:19的比例混合,即為1×DABWashbuffer。室溫保存,6月有效。
4、切片用蒸餾水清洗3次,每次2min。
5、切片入10mlDAB孵育液(提前20℃溫育),避光孵育20min,其間不斷晃動。
6、切片入10mlDAB顯色工作液(提前20℃溫育),避光孵育20min,其間不斷晃動。
7、漂洗:取10ml左右的1×DABWashbuffer漂洗切片2-3次,每次5min。
8、貼片,載玻片用鉻明礬明膠包被,室溫空氣干燥。
9、脫水、透明步驟按如下操作:①蒸餾水10s②70%乙醇10s③95%乙醇10s④100%乙醇2次,每次10s⑤二甲苯2次,每次2~5min。
10、中性樹膠封片,顯微鏡下觀察棕色反應。

注意事項:
1.如果出現高的反應背景或沉淀,表明DAB底物反應過于強烈。
2.所用器皿必須潔凈,避免含有氧化劑或還原劑,否則會產生非特異性反應。
3.DAB顯色液避免反復凍融,以免顯色效率下降。
4.DAB增強劑注意密閉保存,否則顯色效率下降。
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