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化學感受態細胞的規范操作方法

2021-09-06 11:33 作者:洛辰 來源:上海遠慕生物試劑
化學感受態細胞是常規克隆和亞克隆實驗應用較為合適的解決方案。經氯化鈣處理,促進質粒DNA黏附于感受態細胞膜上。將感受態細胞通過水浴熱激,使細胞膜孔打開,從而質??梢赃M入。

操作方法:(以下操作均按無菌條件的標準進行)
1、取感受態細胞置于冰浴中,如需分裝可將剛融化細胞懸液分裝到無菌預冷的離心管中,置于冰浴中。一次轉化感受態細胞的建議用量為50-100μl,可以根據實際情況分裝使用。應注意所用DNA體積不要超過感受態細胞懸液體積的十分之一。

以下實驗以100μl感受態細胞為例。
2、向感受態細胞懸液中加入目的DNA(50μl的感受態細胞能夠被1ng超螺旋質粒DNA所飽和),輕輕旋轉離心管以混勻內容物,在冰浴中靜置30分鐘。
3、將離心管置于42℃水浴中放置90秒,然后快速將管轉移到冰浴中,使細胞冷卻2-3分鐘,該過程不要搖動離心管。
4、向每個離心管中加入500μl無菌的SOC或LB培養基(不含抗生素),混勻后置于37℃搖床振蕩培養45分鐘(150轉/分鐘),目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達,使菌體復蘇。
5、將離心管內容物混勻,吸取100μl已轉化的感受態細胞加到含相應抗生素的SOB或LB固體瓊脂培養基上,用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收,倒置平板,37℃培養12-16小時。

注:涂布用量可根據具體實驗來調整。如轉化的DNA總量較多,可取更少量轉化產物涂布平板;反之,如轉化的DNA總量較少,可取200-300μl轉化產物涂布平板。如果預計的克隆較少,可通過離心(4,000rpm,2分鐘)后吸除部分培養液,懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。(涂布剩余的菌液可置于4℃保存,如果次日的轉化菌落數過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養板)

注意事項:
1.進行轉化操作時,應根據相應溫度及無菌條件的要求進行。
2.感受態細胞應保存在-70℃,不可多次凍融和放置時間過長,以避免感受態細胞的轉化效率。
3.為防止轉化實驗不成功,可以保留部分連接反應液,以重新轉化,將損失降到很低的程度。
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