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細胞培養常用設備及實驗技巧

2016-12-26 15:21 作者:洛辰 來源:上海遠慕生物試劑
    細胞培養常用設備及實驗技巧
    常用設備
    準備室的設備:
    單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜(放置未消毒物品)、儲品規(放置消毒過的物品)、包裝臺。
    配液室的設備:
    扭力天平和電子天平(稱量藥品)、PH計(測量培養用液PH值)、磁力攪拌器(配置溶液室攪拌溶液)。
    培養室的設備:
    液氮罐、儲品柜(存放雜物)、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統、低溫冰箱(-80℃)、空調、二氧化碳缸瓶、邊臺(書寫實驗記錄)。必須放在無菌間的設備:離心機(收集細胞)、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO2孵箱(孵育培養物)、水浴鍋、三氧消毒殺菌機、4℃冰箱(放置serum和培養用液)。
    無菌操作
    無菌室的滅菌:
    1.定期打掃無菌室:每周打掃一次,先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等,然后用3‰來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5%過氧乙酸擦拭。
    2.CO2孵箱(培養箱)滅菌:先用3‰新潔爾滅擦拭,然后用75%酒精擦拭或者0.5%過氧乙酸,再用紫外燈照射
    3.實驗前滅菌:打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統各20-30分鐘
    4.實驗后滅菌:用75%酒精(3‰新潔爾滅)擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。
    實驗人員的無菌準備:
    1.肥皂洗手。
    2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋
    3.用75%酒精棉球擦凈雙手。
    無菌操作的演示:
    1.凡是帶入超凈工作臺內的酒精、PBS、培養基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面
    2.靠近酒精燈火焰操作。
    3.器皿使用前必須過火滅菌
    4.繼續使用的器皿(如瓶蓋、滴管)要放在高處,使用時仍要過火。
    5.各種操作要靠近酒精燈,動作要輕、準確,不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。
    6.吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管,防止交叉污染。
    器械的清洗和消毒
    玻璃器械洗消:
    一、新的玻璃器皿的洗消:
    1.自來水刷洗,除去灰塵。
    2.烘干、泡鹽酸:烤箱中烘干,然后再浸入5%稀鹽酸中12小時以除去臟物、鉛、砷等物。
    3.刷洗、烘干:12小時后立即用自來水沖洗,再用洗滌劑刷洗,自來水沖干凈后用烤箱烘干。
    4.泡酸、清洗:用清潔液(重鉻酸鉀120g:濃硫酸200ml:蒸餾水1000ml)浸泡12小時,然后從酸缸內撈出器皿用自來水沖洗15次,最后蒸餾水沖洗3-5次和用雙蒸水過3次。
    5.烘干、包裝:洗干凈后先烘干,然后用牛皮紙(油光紙)包裝。
    6.高壓消毒:包裝好的器皿裝入高壓鍋內蓋好蓋子,打開開關和安全閥,當蒸氣成直線上升時,關閉安全閥,當指針指向15磅時,維持20-30分鐘。
    7.高壓消毒后烘干
    二、舊的玻璃器皿的洗消:
    1.刷洗、烘干:使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中,泡過來蘇爾溶液(洗滌劑)的器皿要用清水刷洗干凈,然后烘干。
    2.泡酸、清洗:烘干后泡入清潔液(酸液),12小時后從酸缸內撈出器皿立即用自來水沖洗(避免蛋白質干涸后粘附于玻璃上難以清洗),再用蒸餾水沖洗3次。
    3.烘干、包裝:洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙(油光紙)等包裝,以便于消毒儲存及防止灰塵和再次被污染。
    4.高壓消毒:包裝好的器皿裝入高壓鍋內,蓋好蓋子,打開開關和安全閥,隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣,當蒸氣成直線冒出3-5分鐘后,關閉安全閥,氣壓表指數隨之上升,當指針指向15磅時,調節電開關維持20-30分鐘即可。(玻璃培養瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上)
    5.烘干備用:因為高壓消毒后器皿會被蒸氣打濕,所以要放入烤箱內烘干備用。
    金屬器械洗消:
    金屬器皿不能泡酸,洗消時可先用洗滌劑刷洗,后用自來水沖干凈,然后用75%酒精擦拭,再用自來水,然后用蒸餾水沖洗,再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內包裝好在高壓鍋內15磅高壓(30分鐘)消毒,再烘干備用。
    橡膠和塑料:
    橡膠和制品通常處理方法是:先用洗滌劑洗刷干凈,再分別用自來水和蒸餾水沖干凈,再用烤箱烘干,然后根據不同品質進行如下的處理程序:
    1.針式濾器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小時,或者煮沸20分鐘,在包裝之前要裝好濾膜兩張,安裝濾膜時注意光面朝上(凹向上),然后將螺旋稍微擰松一些,放入鋁盒中在高壓鍋內15磅30分鐘消毒,再烘干備用。注意在超凈臺內取出使用時應該立即將螺旋旋緊。
    2.膠塞烘干后用2%氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘(用過的膠塞只要用沸水處理30分鐘),自來水洗凈,烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘,再用自來水,蒸餾水,三蒸水洗凈,烘干。最后裝入鋁盒內高壓消毒,烘干備用。
    3.膠帽,離心管帽烘干后只能在2%氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時(切記時間不能過長),自來水洗凈,烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘,再用自來水,蒸餾水,三蒸水洗凈,烘干。最后裝入鋁盒內高壓消毒,烘干備用。
    4.膠頭可用75%酒精浸泡5分鐘,然后紫外照射后使用即可。
    5.塑料培養瓶,培養板,凍存管:
    6.其他消毒方法:有的物品既不能干燥消毒,又不能蒸氣消毒,可用70%酒精浸泡消毒。塑料培養皿打開蓋子,放在超凈臺臺面上,直接暴露在紫外線下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品,消毒后需要用2—3周時間洗除殘留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射線消毒塑料制品效果。
    為了防止清洗器材已消毒與末消毒發生混淆,可在紙包裝后,用密寫墨水作好標記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水,在包裝紙上作一記號,平時這種墨水不帶痕跡,一經高溫,即出現字跡,從而可以判定它們是否消毒。密寫墨水的配制:氯化鉆(CoC12?6H2o)2g,30%鹽酸10m1,蒸餾水88m1。
    注意事項:
    1.嚴格執行高壓鍋的操作規程:高壓消毒時,先檢查鍋內是否有蒸餾水,以防高壓時燒干,水不能過多因為其將使空氣流暢受阻,會降低高壓消毒效果。檢查安全閥是否通暢,以防高壓時爆炸。
    2.安裝濾膜時注意光面朝上:注意濾膜光滑一面是正面,要朝上,否則起不到過濾的作用。
    3.注意人體的防護和器皿的完全浸泡:A.泡酸時要戴耐酸手套,防止酸液濺起傷害人體。B.從酸缸內撈取器皿時防止酸液濺到地面,會腐蝕地面。C.器皿浸入酸液中要完全,不能留有氣泡,以防止泡酸不徹底。
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