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動物組織中DNA的制備

2016-11-29 16:08 作者:洛辰 來源:上海遠慕生物試劑
由上海遠慕生物提供-以下詳情僅作為參考,具體來電咨詢!

關鍵詞:動物 動物組織 DNA制備

(一)原 理

DNA是所有生物體的基本組成物質。真核生物DNA主要存在于細胞核中。制備DNA時應將細胞核膜打破方能釋放出來。

細胞中的DNA和RNA分別與蛋白質相結合,形成脫氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。在細胞破碎后,這兩種核蛋白將混雜在一起。因此,要制備DNA首先要將這兩種核蛋白分開。已知這兩種核蛋白在不同濃度的鹽溶液中具有不同的溶解度,如在0.15mol/L NaC1的稀鹽溶液中核糖核蛋白的溶解度最大,脫氧核糖核蛋白的溶解度則最?。▋H約為在純水中的1%);而在l mol/L NaCl的濃鹽溶液中,脫氧核糖核蛋白的溶解度增大,至少是在純水中的2倍,核糖核蛋白的溶解度則明顯降低。根據這種特性,調整鹽濃度即可把這兩種核蛋白分開。因此,在細胞破碎后,用稀鹽溶液,反復清洗,所得沉淀即為脫氧核糖核蛋白成分。

分離得到的脫氧核糖核蛋白,用十二烷基硫酸鈉(SDS)使蛋白質成分變性,讓DNA游離出來,再用含有異戊醇的氯仿沉淀除去變性蛋白質。最后根據核酸只溶于水而不溶于有機溶劑的特點,加入95%的乙醇即可從除去蛋白質的溶液中把DNA沉淀出來,獲得產品。

當細胞破碎時,細胞內的脫氧核糖核酸酶(DNase)立即開始降解DNA,如果在破碎細胞后不及時采取抑制酶活的措施,最后將會得不到任何DNA。為此,如在本實驗中加入檸檬酸鹽、EDTA等螯合劑以除DNase必需的Mg2+離子,使DNase活性降低,并要求整個分離制備的過程均在4℃以下進行,以減少DNase的降解作用,最后加入SDS使所有的蛋白質(包括DNase)變性。當然如果希望獲得更大分子的DNA時,則在細胞破碎后,及時加入SDS使蛋白質(包括DNase)變性,并加入蛋白酶K,降解所有的蛋白質成為碎片或氨基酸,及時阻止DNase的降解作用。

DNA分子很大、很長,在水中呈黏稠狀,但DNA鏈的雙螺旋結構不宜小角度的折疊,使之DNA分子具有剛性,即分子是僵直的(stiff),小角度的折疊和壓擠等剪切力,將使DNA斷裂成碎片。為保證獲得大分子DNA,操作時應避免急裂振搖,或過大的離心力。轉移吸取DNA時不可用過細的吸頭,不可猛吸猛放,更不能用細的吸頭反復吹吸。

大分子DNA的水溶液呈黏稠狀,可以用玻璃棒纏起來。液體DNA只要防止DNase污染和高鹽濃度條件下能在液體狀態保存;抽干后的固體DNA,性質穩定,可長期保存。

生物體內各部位的DNA是相同的,但取材時以含量豐富的部位為主,如動物的肝臟、脾、腎、血液、精子等。所有材料,必須新鮮及時使用,或放入-20℃冰箱或液氮冷凍保存。

DNA的含量及純度可用紫外吸收法、定磷法及化學法等測定。

(二)試劑及器材

(1) 0.15mol/L NaCl – 0.015mol/L pH7.0檸檬酸鈉溶液:稱取8.77g NaCl,4.41g檸檬酸三鈉(Na3C6H507 · 2H20),用約800ml蒸餾水溶解后,調節pH至7.0,最后定容至1 000ml。

(2) 0.15mol/L NaCl – 0.1mol/L EDTANa2溶液:稱取8.77g NaCl,37.2g EDTANa2溶于約800ml蒸餾水中,以NaOH調pH至8.0,最后定容至1 000ml。

(3) 5%(W/V)十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液:稱取5g SDS溶于45%(V/V)100ml的乙醇中。

(4) 氯仿– 異戊醇溶液:按氯仿:異戊醇=24:1配制。
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