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免疫球蛋白IgG的提取

2016-11-29 16:04 作者:洛辰 來源:上海遠慕生物試劑
有上海遠慕生物提供,僅參考,詳情請來電!

一、目的及要求
了解和掌握免疫球蛋白的提取方法。

二、概 念
抗體是在抗原物質刺激下,人或脊椎動物免疫系統的漿細胞產生的,能與抗原發生特異性反應的免疫球蛋白,主要存在于人和動物的血清及其體液中。

三、免疫血清的制備
(一)動物的選擇
實驗室常用的動物是家兔和羊,有時也用豚鼠或雞,大量制備商品性抗血清時,可采用馬、牛等大動物。對動物的基本要求是:
1、與抗原物質的種屬關系越遠越好;
2、發育成熟、健壯、體重合乎規定,如家兔要求體重在2~3Kg以上;
3、最好為成年雄性動物,如用雌性動物,則不得用懷孕者。

(二)抗原的種類、質量要求及用量
1、抗原的種類
抗原是決定所制備免疫血清特異性的關鍵,在免疫前必須進行鑒定。
制備免疫血清的抗原可以分為以下三類:
1)微生物抗原:如細菌、病毒、立克次氏體、螺旋體、真菌等;
2)組織抗原:主要是各種蛋白質或蛋白質復合物,如各種酶類、激素、結締組織成分、血漿蛋白、腫瘤組織等;
3)免疫球蛋白抗原:這種抗原在免疫熒光和免疫酶技術中應用最廣;
2、抗原的純度
抗原純度要高,應用病原微生物時,應選擇抗原性強、穩定和標準的菌株或毒株。細菌性抗原應避免有培養基成分,培養病毒的組織盡量采用與被免疫動物同種的組織,培養用的生長液也應避免含有抗原性強的物質,用Hank ′s氏液等為好。
3、抗原的用量
抗原量過小,不能有效地刺激機體產生抗體;抗原量過大,也影響抗體的產生,所以抗原量要適當??乖昧恳暱乖N類、劑型和注射途徑而異。采用弗氏佐劑,劑量較小,一次注射劑量以1mg/kg體重為宜,不加佐劑的劑量要大10倍以上。靜脈注射劑量要小些,以免引起動物死亡。

(三)免疫的途徑與方法
免疫途徑應是多種多樣的,如靜脈、腹腔、肌肉、皮內、皮下和淋巴結等,但肌肉和皮內兩種途徑較少應用。目前一般傾向于小劑量、多點、多途徑的方法,但具體應視抗原的生物學特性和理化特性來決定。酶、毒素等生物活性抗原,一般不宜采用靜脈注射。球蛋白抗原免疫可選用皮下、皮內和肌肉注射。但效價不高,因此大都選用抗原加弗氏佐劑、足掌皮下注射的方法,或者注卡介苗使腘淋巴結腫脹,然后直接注入腘淋巴結內的方法,增強抗體的產生。
足掌注射為近年來常用的免疫途徑,能獲得相當良好的效果,但劑量不宜過大,一般家兔0.2~0.5mL,否則腫脹嚴重。有的采用先經足掌內注射卡介苗(后足掌各注 0.2~0.5mL)。10~14d后,腘淋巴結腫大,然后向淋巴結內注射加有完全佐劑的抗原,兩側各0.5mL左右,半個月后再注射不加佐劑的抗原(3mg/mL)皮下或肌肉多點注射,每點0.1mL,總量0.5mL左右、這樣免疫效果較為理想。
注射次數可分為一次注射和多次注射兩種。一次注射,抗體產生的慢,效價低,但特異性高,如果再次注射,抗體產生的快,效價高,持續時間也較久。多次注射,可得高效價血清,但往往特異性較差.多次免疫的間隔時間,可因抗原性質不同而異。

(四)佐劑
佐劑是一種和抗原一起免疫動物,能增強抗原的免疫原性,加強抗體形成的物質,如明礬、磷酸鋁、氫氧化鋁、結核分枝桿菌、短小棒狀桿菌和細菌內毒素等。
細菌、細胞等顆粒性抗原的免疫原性較好,通常均用其懸液直接免疫,不加佐劑??扇苄钥乖?,尤其純化制劑,一般免疫原性較低,應該加入一定的佐劑,以提高其免疫效能。
目前常用弗氏佐劑(Freundt′sadiuvant),其主要成分為羊毛脂、石蠟油和卡介苗所組成。有卡介苗為弗氏完全佐劑,不加卡介苗為弗氏不完全佐劑。弗氏佐劑配方有多種,羊毛脂與石蠟油之比,一般為1︰2(羊毛脂10g加液體石蠟油20mL),也有用1︰3、1︰4甚至1︰9 的,應根據藥品質量而定。先將羊毛脂與石蠟油按比例混合好,羊毛脂1份、液體石蠟油2~4份,混勻,高壓滅菌,冰箱保存,臨用前與等量抗原溶液混和研磨,乳化,即為弗氏不完全佐劑抗原。如在其中加入2~4mg/mL卡介苗(100℃、10min殺菌),則稱為弗氏完全佐劑抗原。充分乳化是獲得良好免疫效果的關鍵,如果放置后油水分層,表明乳化不良,滴于水上不擴散為乳化良好.有時可加入1%Tween-80,以加強乳化效果。
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